mercoledì 11 marzo 2020

Trattamento della Polmonite causata dal 2019-nCovid (novel Coronavirus) con alte dosi di Vitamina C (articolo scientifico)



traduzione Nannai

Richard Z Cheng, MD, PhD; Hanping Shi, MD, PhD; Atsuo Yanagisawa, MD, PhD; Thomas Levy, MD, JD; Andrew Saul, PhD.


(OMNS, 16 febbraio 2020) L'epidemia di 2019-nCov (coronavirus) è nata a Wuhan, in Cina, e si sta diffondendo in molti altri continenti e paesi, causando una paura pubblica. Peggio ancora, non sono disponibili vaccini o specifici farmaci antivirali per 2019-nCov. Ciò si aggiunge alla paura pubblica e alla visione cupa. È urgentemente necessario un trattamento rapido, rapidamente dispiegabile e accessibile, efficace e sicuro, non solo per salvare quei pazienti, per ridurre la diffusione dell'epidemia, ma anche molto importante nell'assicurazione psicologica per le persone di tutto il mondo, e in particolare per i cinesi. L'Insufficienza acuta d'organo, in particolare l'insufficienza polmonare ( sindrome da distress respiratorio acuto, ARDS) è il meccanismo chiave per la fatalità di 2019-nCov. Lo stress ossidativo significativamente aumentato dovuto al rapido rilascio di radicali liberi, citochine ecc. È il segno distintivo di ARDS che porta a lesioni cellulari, insufficienza d'organo e morte. L'uso precoce di antiossidanti ad alte dosi, in particolare la vitamina C (VC) , svolge quindi un ruolo chiave nella gestione di questi pazienti. Chiediamo a tutti coloro che sono alla guida e a quelli che forniscono assistenza diretta ai pazienti di applicare coraggiosamente e rapidamente alte dosi di vitamina C per via endovenosa (IVC) per aiutare quei pazienti e fermare questa epidemia.
2019-nCov è un'epidemia in rapido sviluppo con un'alta morbilità e mortalità.
Wang et al. riportano il 26% di ricovero in terapia intensiva e un tasso di mortalità del 4,3% nei loro 138 casi confermati [1] . Chen e tutti riportano che su 99 pazienti confermati 2019-nCov, 17 (17%) pazienti hanno sviluppato ARDS e, tra questi, 11 (11%) pazienti sono peggiorati in un breve periodo di tempo e sono morti per insufficienza multipla d'organo.
L'aumento dello stress ossidativo, una "tempesta di citochine" sottostante, porta all'ARDS che è la patologia chiave dell'alta mortalità di queste infezioni virali pandemiche. L'ARDS indotta dalla tempesta di citochine è la patologia chiave che porta alla morte di questi pazienti [2] . La vitamina C endovenosa contrasta efficacemente lo stress ossidativo.

Tempesta di citochine
I coronavirus e l'influenza sono tra i virus pandemici che possono causare lesioni polmonari letali e morte per ARDS [3] . Le infezioni virali provocano una "tempesta di citochine" che può attivare le cellule endoteliali dei capillari polmonari portando a infiltrazioni di neutrofili e aumento dello stress ossidativo (ossigeno reattivo e specie di azoto) che danneggiano ulteriormente la funzione di barriera polmonare [3] . L'ARDS, caratterizzata da grave ipossiemia, è generalmente accompagnata da infiammazione incontrollata, lesioni ossidative e danni alla barriera alveolare-capillare [4]. L'aumento dello stress ossidativo è un grave insulto nella lesione polmonare come la lesione polmonare acuta (ALI) e la sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS), due manifestazioni cliniche di insufficienza respiratoria acuta con morbilità e mortalità sostanzialmente elevate [5,6] .
In un rapporto di 29 pazienti confermati nei pazienti con polmonite 2019-nCov, 27 (93%) hanno mostrato un aumento dell'hsCRP, un marker di infiammazione (e stress ossidativo[7] . Fattore di trascrizione Il fattore 2 correlato all'eritroide 2 (Nrf2) è un importante regolatore dell'espressione della proteina citoprotettiva guidata dall'elemento di risposta antiossidante (ARE). L'attivazione della segnalazione Nrf2 svolge un ruolo essenziale nel prevenire cellule e tessuti da lesioni indotte da stress ossidativo. La vitamina C è un elemento essenziale del sistema antiossidante nella risposta cellulare [8] .
Parte degli effetti biologici della vitamina C nella gestione delle cure critiche sono stati rivisti in un recente articolo di Nabzdyk e Bittner della Mass Gen Hospital della Harvard Medical School sul World Journal of Critical Care Medicine [9] :

Antiossidante, scavenger di ossigeno radicale che protegge le cellule dalla sintesi ossidativa di steroidi e catecolamine, cofattore in catecolamina, vasopressina e sintesi di steroidi, migliora l'emodinamica, può accelerare la risoluzione dello shock

Funzione cellulare immunitaria. Aumenta la fagocitosi e la chemiotassi dei neutrofili, influenza la migrazione dei macrofagi, migliora la proliferazione delle cellule T e NK, modula la loro funzione, può aumentare la formazione di anticorpi.

Funzione delle cellule endoteliali. Diminuisce l'espressione dell'ICAM dell'endotelio e l'adesione dei leucociti, migliora la funzione di barriera endoteliale, migliora la microcircolazione

La produzione di carnitina, modula il metabolismo degli acidi grassi, può migliorare la microcircolazione e la funzione cardiaca

Guarigione delle ferite, cofattore della sintesi del collagene, mitogeno per fibroblasti


Antiossidanti, in particolare grandi dosi di vitamina C IV (IVC) nella gestione dell'ARDS.
È chiaro che l'aumento dello stress ossidativo svolge un ruolo importante nella patogenesi dell'ARDS e della morte. La tempesta di citochine è osservata sia nelle infezioni virali che batteriche [3] . La tempesta di citochine porta ad un aumento dello stress ossidativo, l'ARDS e la morte sembrano essere un percorso comune e non specifico. Questo è importante nella gestione clinica. Poiché la prevenzione e la gestione mirate all'aumento dello stress ossidativo con una grande dose di antiossidanti sembrano un passo logico e possono essere applicati a queste pandemie mortali, senza la lunga attesa di vaccini e farmaci specifici per i patogeni, come nel caso dell'attuale epidemia 2019-nCov .
È un dato di fatto, la vitamina C endovenosa ad alta dose (IVC) è stata utilizzata clinicamente con successo nell'ARDS virale e anche nell'influenza [10] . Fowler et al. descrissero che una donna di 26 anni aveva sviluppato ARDS virale (rinovirus e enterovirus-D68) [3]. È stata ammessa in terapia intensiva. Dopo il fallimento della gestione standard di routine, è stata posta all'ECMO il giorno 3. Il dosaggio elevato di IVC (200 mg / kg di corpo / 24 ore, suddiviso in 4 dosi, uno ogni 6 ore) è stato avviato anche il giorno 1 dell'ECMO. miglioramento il giorno 2 dell'infusione di IVC ad alte dosi sull'imaging a raggi X. Ha continuato a migliorare ECMO e IVC ed ECMO è stata interrotta il giorno 7 dell' ECMO e il paziente è guarito ed è stato dimesso dall'ospedale il giorno 12, senza la necessità di ossigeno supplementare. Un mese dopo, la radiografia dei suoi polmoni ha mostrato un completo recupero. Gonzalez et al. (Tra cui uno degli autori, Thomas Levy) hanno recentemente riportato un caso grave di influenza trattato con successo con IVC ad alte dosi [10]. MG di 25 anni ha sviluppato sintomi simil-influenzali che si stavano rapidamente deteriorando nella misura in cui, circa 2 settimane dopo, il paziente aveva a malapena l'energia per usare il bagno. È stato sottoposto ad alte dosi di IVC (50.000 mg di vitamina C in 1000 ml di soluzione di Ringer, infuso in 90 minuti). Il paziente ha riportato immediatamente un miglioramento significativo il giorno successivo. Il giorno 4 dell'infusione di IVC ha riferito di sentirsi normale. Ha continuato la VC orale (2.000 mg due volte al giorno) [10] . Un'altra storia è stata ampiamente diffusa sui social media secondo cui, secondo quanto riferito, nel 2009 è stata utilizzata una grande dose di IVC per salvare un agricoltore della Nuova Zelanda, Alan Smith (Primal Panacea). Uno di noi (Thomas Levy) è stato consultato in questo caso [11] [12]Hemila et al. Hanno riferito che la vitamina C riduce la permanenza in terapia intensiva nella loro meta-analisi del 2019 di 18 studi clinici con un totale di 2004 pazienti in terapia intensiva sulla rivista Nutrients [13] . In questo rapporto, 17.000 mg / die di IVC hanno ridotto la permanenza in terapia intensiva del 44%. Marik et al. Hanno riferito del loro uso di IVC in 47 casi di terapia intensiva in sepsi. Hanno trovato una riduzione significativa del tasso di mortalità nel gruppo di pazienti con IVC [14] .
Gli antiossidanti dietetici (vitamina C e sulforaphane) hanno dimostrato di ridurre il danno polmonare infiammatorio acuto indotto da stress ossidativo nei pazienti sottoposti a ventilazione meccanica [15]. Altri antiossidanti (curcumina) hanno anche dimostrato di avere un promettente potenziale antinfiammatorio nella polmonite [16] .
L'IVC ad alte dosi è stato clinicamente utilizzato per diversi decenni e un recente documento del gruppo di esperti NIH afferma chiaramente che l'IVC ad alte dosi (1,5 g / kg di peso corporeo) è sicuro e senza effetti collaterali importanti [17] .
Sommario
La polmonite 2019-nCov è una malattia in rapido sviluppo con alto tasso di morbilità e mortalità. La patogenesi chiave è la lesione polmonare acuta che causa ARDS e morte. I coronavirus, i virus dell'influenza e molte altre infezioni virali pandemiche sono di solito associati a un aumento dello stress ossidativo dovuto al danno cellulare ossidativo con conseguente insufficienza multiorgano. La somministrazione di antiossidanti ha quindi un ruolo centrale nella gestione di queste condizioni, oltre alle terapie di supporto convenzionali standard. Studi clinici preliminari e case report mostrano che la somministrazione precoce di IVC ad alte dosi può migliorare le condizioni cliniche dei pazienti in terapia intensiva, ARDS e influenza. Bisogna sottolineare che in futuro si verificheranno pandemie come 2019-nCov. Vaccini specifici e farmaci antivirali R & D impiega molto tempo a svilupparsi e non è disponibile per l'attuale epidemia di nCov e non sarà pronto quando si verificherà la prossima pandemia. IVC e altri antiossidanti sono agenti universali per ARDS che possono essere rapidamente applicati clinicamente. Dato che l'IVC ad alte dosi è sicuro, può essere efficace, chiediamo ai dirigenti coinvolti e agli operatori sanitari di esaminare l'IVC ad alte dosi senza ulteriori ritardi. Sono necessari ulteriori studi clinici sull'IVC e sul VC orale (come la Vitamina C liposomiale incapsulata) per sviluppare protocolli standard per l'uso corrente e sono urgentemente necessari usi futuri. Speriamo che quando scoppierà la prossima pandemia, non saremo così indifesi e saremo pronti. 

Per ulteriori letture
I pazienti con coronavirus in Cina saranno trattati con vitamina C ad alte dosi http://orthomolecular.org/resources/omns/v16n10.shtml Alla data di pubblicazione del comunicato stampa del servizio di medicina ortomolecolare, il Dr. Cheng è a Wuhan per facilitare l'IVC trattamento per pazienti ospedalizzati con coronavirus.
Vitamina C e sua applicazione al trattamento di nCoV Coronavirus
Terapia endovenosa in ospedale con vitamina C per coronavirus e malattie correlate
Trattamento nutrizionale del coronavirus
La vitamina C protegge contro il coronavirus

Riferimenti

1. Wang D, Hu B, Hu C, Zhu F, Liu X, Zhang J, Wang B, Xiang H, Cheng Z, Xiong Y, Zhao Y, Li Y, Wang X, Peng Z. Caratteristiche cliniche di 138 pazienti ospedalizzati Con il romanzo 2019 Polmonite infetta da coronavirus a Wuhan, in Cina. JAMA. 2020, 7 febbraio;

2. Chen N, Zhou M, Dong X, Qu J, Gong F, Han Y, Qiu Y, Wang J, Liu Y, Wei Y, Xia J, Yu T, Zhang X, Zhang L. Caratteristiche epidemiologiche e cliniche di 99 casi del 2019 romanzo polmonite da coronavirus a Wuhan, Cina: uno studio descrittivo. Lancet Lond Engl. 30 gennaio 2020;

3. Fowler III AA, Kim C, Lepler L, Malhotra R, Debesa O, Natarajan R, Fisher BJ, Syed A, DeWilde C, Friday A, Kasirajan V. La vitamina C endovenosa come terapia aggiuntiva per enterovirus / rinovirus ha provocato difficoltà respiratoria acuta sindrome. World J Crit Care Med. 4 febbraio 2017; 6 (1): 85-90.

4. Meng L, Zhao X, Zhang H. L'interferenza HIPK1 attenua l'infiammazione e lo stress ossidativo delle lesioni polmonari acute attraverso l'autofagia. Med Sci Monit Int Med J Exp Clin Res. 29 gennaio 2019; 25: 827-35.

5. Yan X, Fu X, Jia Y, Ma X, Tao J, Yang T, Ma H, Liang X, Liu X, Yang J, Wei J. Nrf2 / Keap1 / ARE Signaling Mediata una protezione antiossidante dello stelo mesenchimale placentare umano Cellule di origine fetale nelle cellule epiteliali alveolari. Oxid Med Cell Longev. 2019; 2019: 2.654.910.

6. Hecker L. Meccanismi e conseguenze dello stress ossidativo nelle malattie polmonari: implicazioni terapeutiche per l'invecchiamento della popolazione. Am J Physiol Cellula polmonare Mol Physiol. 2018 01; 314 (4): L642-53.
7. Chen L, Liu HG, Liu W, Liu J, Liu K, Shang J, Deng Y, Wei S. [Analisi delle caratteristiche cliniche di 29 pazienti con polmonite da coronavirus del romanzo 2019]. Zhonghua Jie He He Hu Xi Za Zhi Zhonghua Jiehe He Huxi Zazhi Chin J Tuberc Respir Dis. 2020 6 febbraio; 43 (0): E005.

8. Liu Q, Gao Y, Ci X. Ruolo di Nrf2 e dei suoi attivatori nelle malattie respiratorie. Oxid Med Cell Longev. 2019; 2019: 7.090.534.

9. Nabzdyk CS, Bittner EA. La vitamina C in condizioni critiche - indicazioni e controversie. World J Crit Care Med. 16 ottobre 2018; 7 (5): 52-61.

10. Alta dose di vitamina C e influenza: un caso clinico - ISOM [Internet]. [citato il 9 febbraio 2020]. Disponibile da: https://isom.ca/article/high-dose-vitamin-c-influenza-case-report/?from=groupmessage&isappinstalled=0

11. Levy T. Primal Panacea. Editoria MedFox; 350 p. (Edizione Kindle).

12. Levy TE. Primal Panacea. Medfox Pub, 2012. Kindle, 2017.

13. Hemilä H, Chalker E. La vitamina C può ridurre la durata della degenza in terapia intensiva: una meta-analisi. Nutrienti. 27 mar 2019; 11 (4).

14. Marik PE, Khangoora V, Rivera R, Hooper MH, Catravas J. Hydrocortisone, Vitamina C e Tiamina per il trattamento della sepsi grave e dello shock settico: uno studio retrospettivo prima-dopo. Il petto. 2017; 151 (6): 1229-1238.

15. Patel V, quadrante K, Wu J, Gauthier AG, Wu W, Lin M, Espey MG, Thomas DD, Jr CRA, Mantell LL. Gli antiossidanti dietetici attenuano significativamente le lesioni polmonari infiammatorie acute indotte dall'iperossia migliorando la funzione dei macrofagi attraverso la riduzione dell'accumulo delle vie aeree HMGB1. Int J Mol Sci. 2020 1 febbraio; 21 (3).

16. Zhang B, Swamy S, Balijepalli S, Panicker S, Mooliyil J, Sherman MA, Parkkinen J, Raghavendran K, Suresh MV. La consegna polmonare diretta della curcumina solubilizzata riduce la gravità della polmonite letale. FASEB J Off Publ Fed Am Soc Exp Biol. 2019 dic; 33 (12): 13294-309.

17. Vitamina C ad alto dosaggio (PDQ (r)) - Versione professionale per la salute - National Cancer Institute [Internet]. [citato il 9 febbraio 2020]. Disponibile da: https://www.cancer.gov/about-cancer/treatment/cam/hp/vitamin-c-pdq


mercoledì 4 marzo 2020

Sito di scissione e maturazione simile alla Furina nel sito 2 della Proteina S del Coronavirus 2019-nCovid



La glicoproteina a spillo del nuovo coronavirus 2019-nCoV contiene un sito di scissione simile alla furina assente in CoV dello stesso clade

The spike glycoprotein of the new coronavirus 2019-nCoV contains a furin-like cleavage site absent in CoV of the same clade.

Traduzione Nannai
Premessa traduttore:
Questo articolo originariamente pubblicato qui nella rivista Antiviral Research è di interessante importanza per il suo contenuto, da qui la traduzione in italiano. In particolare nell'articolo si mette in evidenza il sito di clivaggio o di scissione della proteina S del Coronavirus che è la proteina strutturale che conferisce al virus la tipica forma a corona e che conferisce il nome all'intera famiglia dei Coronaviridae.  La proteina S lunga 1200 amminoacidi è una proteina di fusione che contribuisce al legame del virus al recettore che si trova sulla cellula umana. Principalmente, si tratta delle cellule delle vie respiratorie. Inoltre favorisce il tropismo nei tessuti e la patogenesi del virus. Questa proteina S" viene scissa da proteine della cellula ospite che si trovano sulla superficie cellulare. Dopo la scissione, meccanismo noto come innesco, la proteina S riconosce un recettore sulla cellula che permette al virus nCovid-2019 l'ingresso virus all'interno della cellula ospite facilitandogli la conquista del suo armamentario biologico (enzimi e nutrienti) per la  moltiplicazione e diffusione.
La cosa interessante è che questa modifica nella struttura della proteina S è assente nel SARS-Cov infatti come sottolineato dagli autori si ha che la SARS penetra attraverso ACE2 comune nelle cellule epiteliali dei polmoni: 
"La proteina SARS-CoV S1 contiene un dominio di recettore conservato (RBD), che riconosce l'enzima 2 di conversione dell'angiotensina (ACE2)"
Mentre nel Covid-2019 dei 14 aminoacidi della proteina di SARS solo 8 rimangono conservati facendo del recettore ACE2 il probabile recettore d'ingresso del nuovo virus. Mentre, come si legge di seguito, al contrario di SARS-CoV, il virus Covid-2019 matura in seguito all'azione di una proteasi simil furina che scinde la proteina S virale durante l'uscita del virus. 
"Quindi, secondo gli autori, è probabile che il processo di innesco sia assicurato da diverse proteasi delle cellule ospiti a seconda della sequenza del sito di scissione S1 / S2. Di conseguenza, la proteina S MERS-CoV, che contiene un motivo R SV R ↓ S V, viene scissa durante l'uscita del virus, probabilmente per azione della furinaMille e Whittaker, 2014 ). Al contrario, la proteina S della SARS-CoV rimane in gran parte incompiuta dopo la biosintesi, probabilmente a causa della mancanza di un sito di scissione simile alla furina (SLL R-ST). In questo caso, è stato riportato che in seguito al legame del recettore la proteina S viene suddivisa in una sequenza conservata AYT ↓ M (situata a 10 aa valle di SLL R -ST) dalle proteasi delle cellule bersaglio come elastasi, cathepsin L o TMPRSS2Bosch et al., 2008 ; Matsuyama et al., 2010 , 2005 ; Millet and Whittaker, 2015".
Dunque, questo sito di scissione simile alla furina conferisce al nCovid-2019 un guadagno di funzione (gain-of-function) al virus conferendogli una efficace diffusione nella popolazione umana rispetto ad altri Coronavirus.
Così come affermato dagli autori dell'articolo:
Questo sito di scissione simile alla furina, dovrebbe essere scisso durante l'uscita del virus ( Mille and Whittaker, 2014) per il "priming" della proteina S e può fornire un guadagno di funzione (gain-of-function) al 2019-nCoV per un'efficace diffusione nella popolazione umana rispetto ad altri betacoronavirus della discendenza b. 
Il guadagno di funzione risulta essere un meccanismo con cui di solito nei laboratori di BSL-4 si inserisce volutamente una caratteristica, un sito di clivaggio o un gene, usando delle metodiche che in questo breve filmato vengono spiegate.
Ed è proprio questo gain-of-function nel sito del clivaggio della proteina S riconosciuta da una proteasi cellulare simil-furina che ha spinto il prof Dr. Francis A. Boyleeminente esperto di diritto internazionale americano; oltre professore all'Università dell'Illinois e responsabile della stesura della legge antiterrorismo sulle armi biologiche dell'89, che è stata adottata nel diritto mondiale, ed ha steso la legislazione di attuazione americana per la convenzione sulle armi biologiche. Ha servito nel Consiglio di Amministrazione di Amnesty International e ha rappresentato la Bosnia ed Erzegovina alla corte mondiale a ipotizzare ad un'arma biologica sfuggita dal laboratorio di BSL-4 di Wuhan, come si può leggere in queste due interviste tradotte:

Intervista Completa a Francis Boyle – Il Coronavirus di Wuhan è un Arma Offensiva di Guerra Biologica


Il Covid.2019 : Chimera virale usata come arma Biologica sfuggita dal BLS-4 di Wuhan. Seconda Intervista di Alex Jones al prof Francis Boyle.


La ricerca sul guadagno di funzione (GOF) implica una sperimentazione che mira ad aumentare la trasmissibilità e / o la virulenza dei patogeni.

Il sito di clivaggio sulla proteina S riconosciuta dalla furina è comune anche ad altri due patogeni l'antrace (Bacillus anthracis) e il virus dell'influenza H5N1 che ha colpito Hong Kong nel 1997. Come si può leggere in questo estratto dall'articolo FURIN AT THE CUTTING EDGE: FROM PROTEIN TRAFFIC TO EMBRYOGENESIS AND DISEASE

Riquadro 2 Furina e bioterrorismo

La trama del bioterrorismo in seguito alla tragedia del World Trade Center dell'11 settembre 2001 ha tentato di infliggere innumerevoli morti diffondendo spore di Bacillus anthracis attraverso il sistema postale. A 22 persone è stata diagnosticata l'antrace contratta dal contatto con posta contaminata - cinque sono morti entro pochi giorni dall'esposizione  , Tuttavia, le strutture di smistamento interessate hanno processato 85 milioni di pezzi di posta dopo l'invio delle lettere contaminate, rafforzando la nostra vicinanza al disastro. E l'antrace non è solo nella sua capacità di innescare il disastro. Ricorda stranamente la pandemia influenzale che potrebbe essere scoppiata a Hong Kong nel 1997, quando un virus patogeno dell'influenza aviaria patogena - in grado di saltare direttamente dagli uccelli agli umani - ha ucciso in una settimana sei delle 18 persone a cui è stato diagnosticato clinicamente l'influenza aviaria. Se non fosse stato per l'infettività attenuata di questo virus influenzale H5N1, il bilancio delle vittime dell'epidemia avrebbe potuto essere ben peggiore. Oltre a illustrare la nostra vulnerabilità ai microrganismi mortali, esiste un altro collegamento tra queste due chiamate ravvicinate, e quel collegamento è la furina,

Come si vede la furina è in grado di attivare delle proproteine di diversi agenti patogeni che come abbiamo visto nel riquadro sono l'antrace e il virus dell'influenza aviaria. Fino a poco tempo fa, si pensava che la furina fosse una proteina non affascinante; tuttavia, il ruolo cruciale della furina in così tanti diversi eventi cellulari - e in malattie che vanno dall'antrace all'influenza aviaria ( RIQUADRO 2) al cancro, alla demenza e alla febbre causata dall'Ebola - ha indotto i ricercatori a rivalutarla. Tra le varie caratteristiche della furina vi sono: proprietà strutturali ed enzimatiche, autoattivazione, localizzazione intracellulare e motilità; i suoi substrati; e i suoi ruoli in vivo , compreso il requisito della furina nel determinare la patogenicità di molti virus e batteri.

L'antrace fu additato dallo stesso Dr. Francis Boyle come un agente diffuso volutamente per creare il terrore da un laboratorio non credendo al suo uso come arma terroristica, idea che rilasciò in un intervista alla BBC e ad altre reti statunitensi che gli provocarono il divieto assoluto di venir intervistato dai media mainstream. Tutto questo lo si può leggere alla prima intervista linkata di sopra.
Ora vi lascio alla lettura dell'articolo.


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Punti salienti
La sequenza genomica di 2019-nCoV indica che il virus si raggruppa con betacoronavirus della discendenza b.
• La sequenza S-protein 2019-nCoV ha un sito di scissione specifico simile a una furina assente nel lignaggio b CoV comprese le sequenze SARS-CoV.
• Il sito di scissione simile alla furina nella proteina S del 2019-nCoV può avere implicazioni per il ciclo di vita virale e la patogenicità.
• Le campagne per lo sviluppo di terapie anti-2019-nCoV dovrebbero includere la valutazione degli inibitori della furina.
Estratto
Nel 2019, un nuovo coronavirus (2019-nCoV) che infetta gli umani è emerso a Wuhan, in Cina. Il suo genoma è stato sequenziato e le informazioni genomiche sono state prontamente rilasciate. Nonostante un'elevata somiglianza con la sequenza genomica di SARS-CoV e CoV simili a SARS, abbiamo identificato un sito di scissione simile alla furina nella proteina Spike del 2019-nCoV, privo di altri CoV simili a SARS. In questo articolo, discutiamo delle possibili conseguenze funzionali di questo sito di scissione nel ciclo virale, della patogenicità e delle sue potenziali implicazioni nello sviluppo di antivirali.
Tags
2019-picco; SARS; Proteina Spike; Proteasi di maturazione; Furin; antivirali


I Coronavirus umani (CoV) sono virus a RNA avvolti a filamento positivo appartenenti all'ordine Nidovirales e sono principalmente responsabili delle infezioni del tratto respiratorio superiore e del tratto digestivo. Tra questi, SARS-CoV e MERS-CoV, che si sono diffusi rispettivamente nel 2002 e nel 2013, sono stati associati a gravi malattie umane, come polmonite grave e bronchiolite, e persino meningite in popolazioni più vulnerabili ( de Wit et al., 2016 ). Nel dicembre 2019, un nuovo CoV (2019-nCoV) è stato rilevato nella città di Wuhan e questa infezione virale emergente è stata associata a una grave malattia respiratoria umana con un tasso di mortalità del 2-3%Li et al., 2020 ) . Il virus che si presumeva fosse inizialmente stato trasmesso da un serbatoio di animali all'uomo probabilmente attraverso un host amplificatore. Tuttavia è stata segnalata una trasmissione da uomo a uomo, che ha portato a una diffusione epidemica sostenuta con> 31.000 infezioni umane confermate, tra cui> 640 morti, segnalate dall'OMS all'inizio di febbraio 2020. Il valore del numero riproduttivo effettivo stimato (R) di ~ 2,90 (95%: 2,32-3,63) all'inizio dell'epidemia aumenta la possibilità di una pandemia ( Zhao et al., 2020 ). Ciò ha spinto l'OMS a dichiararlo come un'emergenza di sanità pubblica di interesse internazionale. Ciò è particolarmente rilevante perché finora non esistono trattamenti antivirali specifici o vaccini. Basato sulla sua sequenza genomica, 2019-nCoV appartiene al lignaggio b del BetacoronavirusFig. 1A), che include anche SARS-CoV e bat CoV ZXC21, quest'ultimo e il CoV ZC45 sono i più vicini al 2019-nCoV. 2019-nCoV condivide ~ 76% dell'identità della sequenza di aminoacidi nella sequenza di proteine ​​Spike (S) "spillo o chiodo" con SARS-CoV e l'80% con CoV ZXC21 ( Chan et al., 2020 ). In questo articolo, ci concentriamo su uno specifico modello di riconoscimento della proteasi simile alla furina presente in prossimità di uno dei siti di maturazione della proteina S (Fig.1 B) che può avere implicazioni funzionali significative per l'ingresso del virus.


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Fig. 1 .Caratterizzazione di una sequenza peculiare di nCoV nel sito di scissione S1 / S2 nella sequenza di proteine ​​S, rispetto al CoV simile alla SARS. (A) Albero filogenetico di coronavirus selezionati dai generi alphacoronavirus (α-Cov) e betacoronavirus (β-CoV), lignaggi a, b, c e d: 2019-nCoV (NC_045512.2), CoV-ZXC21 (MG772934), SARS -CoV (NC_004718.3), BM4821 simile a SARS (MG772934), HCoV-OC43 (AY391777), HKU9-1 (EF065513), HCoV-NL63 (KF530114.1), HCoV229E (KF514433.1), MERS-CoV ( NC019843.3), HKU1 (NC_006577.2). L'albero filogenetico è stato ottenuto sulla sequenza di amminoacidi Orf1ab usando il metodo Maximum Likelihood dal software Mega X. Gli asterischi rossi indicano la presenza di un motivo di scissione canonico simile alla furina nel sito 1; (B) Allineamento delle sequenze di codifica e aminoacidi della proteina S da CoV-ZXC21 e 2019-nCoV nel sito S1 / S2. La sequenza specifica per 2019-nCoV è in grassetto. La sequenza della proteina S CoV-ZXC21 in questa posizione è rappresentativa della sequenza degli altri betacoronavirus appartenenti al lignaggio b, ad eccezione di quello del 2019-nCoV. (Per l'interpretazione dei riferimenti al colore in questa legenda delle figure, il lettore si riferisce alla versione Web di questo articolo.)
Le convertasi proproteiniche (PC; geni PCSK ) costituiscono una famiglia di nove proteasi secretorie serine che regolano vari processi biologici sia in condizioni di salute che di malattia ( Seidah e Prat, 2012 ). Per proteolisi, i PC sono responsabili dell'attivazione di un'ampia varietà di proteine ​​precursori, quali fattori di crescita, ormoni, recettori e molecole di adesione, nonché glicoproteine ​​della superficie cellulare di virus infettivi ( Seidah e Chretien, 1999 ) ( Tabella 1 ). Sette PC scindono proteine ​​precursori in specifici aminoacidi basici singoli o accoppiati (aa) all'interno del motivo (R / K) - (2X) n- (R / K) ↓, dove n = 0, 1, 2 o 3 distanziatore aa ( Seidah e Chretien, 1999). A causa del loro ruolo nell'elaborazione di molte proteine ​​fondamentali della superficie cellulare, i PC, in particolare la furina, sono stati implicati nelle infezioni virali. Hanno il potenziale di scindere le glicoproteine ​​a inviluppo specificamente virale, migliorando così la fusione virale con le membrane delle cellule ospiti ( Izaguirre, 2019 ; Moulard e Decroly, 2000 ). Nel caso di coronavirus infettivi umani come HCoV-OC43 ( Le Coupanec et al., 2015 ), MERS-CoV ( Millet and Whittaker, 2014 ) e HKU1 ( Chan et al., 2008 ) è stata dimostrata la proteina spike da spaccare in un sito di scissione S1 / S2 ( Fig. 2 ) generando le subunità S1 e S2. I tre virus sopra mostrano il motivo canonico (R / K) - (2X) n- (R / K) ↓ (Tabella 1 ). Inoltre, è stato dimostrato che la variazione attorno al sito di scissione della glicoproteina dell'involucro virale svolge un ruolo nel tropismo cellulare e nella patogenesi. Ad esempio, la patogenesi di alcuni CoV è stata precedentemente correlata alla presenza di un sito di scissione simile alla furina nella sequenza di proteine ​​S. Ad esempio, l'inserimento di un sito di scissione simile nella proteina S del virus della bronchite infettiva (IBV) provoca una maggiore patogenicità, pronunciati sintomi neurali e neurotropismo nei polli infetti ( Cheng et al., 2019 ).
Tabella 1 . Sequenze comparate dei siti di scissione delle proteine ​​dell'involucro nei coronavirus (sopra) e in altri virus RNA (sotto). Scatole vuote: nessun motivo di consenso rilevato.


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Fig. 2 . Rappresentazione schematica della proteina S umana 2019-nCoV con particolare attenzione ai siti di maturazione putativa. I domini erano precedentemente caratterizzati in SARS-CoV e MERS-CoV: segnale peptide (SP), dominio N-terminale (NTD), dominio legante i recettori (RBD), peptide di fusione (FP), peptide di fusione interno (IFP), heptad ripetere 1/2 (HR1 / 2) e il dominio transmembrane (TM). I siti di scissione SP, S1 ↓ S2 e S2 ′ sono indicati da frecce. La sequenza di diversi siti di scissione CoV S1 / S2 e S2 ′ è stata allineata utilizzando il server web Multalin ( http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/ ) con regolazioni manuali e la figura preparata usando ESPript 3 ( http: // espript .ibcp.fr / ESPript / ESPript /) che presenta la struttura secondaria della proteina S SARS-CoV nella parte inferiore dell'allineamento (PDB 5X58 ) ( Yuan et al., 2017 ). L'inserimento del furin come il sito di scissione è circondato da una cornice nera. Gli asterischi rossi indicano la presenza di un motivo di scissione canonico simile alla furina nel sito S1 / S2. (Per l'interpretazione dei riferimenti al colore in questa legenda delle figure, il lettore si riferisce alla versione Web di questo articolo.)
Allo stesso modo, nel caso del virus dell'influenza, le forme a bassa patogenicità del virus dell'influenza contengono un singolo residuo di base nel sito di scissione, che è tagliato da proteasi simili alla tripsina e la distribuzione tissutale delle proteasi attivanti limita tipicamente le infezioni al organi respiratori e / o intestinali ( Sun et al., 2010 ). Al contrario, le forme altamente patogene di influenza hanno un sito di scissione simile alla furina diviso da diverse proteasi cellulari, compresa la furina, che sono espresse in un'ampia varietà di tipi cellulari che consentono un ampliamento del tropismo cellulare del virus ( Kido et al., 2012 ). Inoltre l'inserimento di un motivo multibasico R E R R R K KR ↓ G Lnel sito di scissione dell'emmagglutinina H5N1 era probabilmente associato all'iper virulenza del virus durante l'epidemia di Hong Kong del 1997 ( Claas et al., 1998 ). Questo motivo mostra l'Arg critico a P1 e i residui di base a P2 e P4, così come P6 e P8 e un Leu alifatico in posizioni P2 '( Tabella 1 ) (nomenclatura Schechter e Berger ( Schechter e Berger, 1968 )), tipica di una specificità di scissione simile alla furina ( Braun e Sauter, 2019 ; Izaguirre, 2019 ; Seidah and Prat, 2012 ).
La proteina S del coronavirus è la proteina strutturale responsabile della forma a corona delle particelle virali di CoV, da cui è stato coniato il nome originale "coronavirus". La proteina S lunga ~ 1200 aa appartiene alle proteine ​​di fusione virale di classe I e contribuisce al legame del recettore cellulare, al tropismo dei tessuti e alla patogenesiLu et al., 2015 ; Millet and Whittaker, 2014 ). Contiene diversi domini e motivi conservati ( Fig. 2). La proteina S trimetrica viene processata nel sito di scissione S1 / S2 dalle proteasi delle cellule ospiti, durante l'infezione. Dopo la scissione, nota anche come innesco, la proteina viene divisa in un ectodominio S1 N-terminale che riconosce un recettore della superficie cellulare cognitiva e una proteina ancorata alla membrana S2 C-terminale coinvolta nell'ingresso virale. La proteina SARS-CoV S1 contiene un dominio di recettore conservato (RBD), che riconosce l'enzima 2 di conversione dell'angiotensina (ACE2) ( Li et al., 2003 ). Il SARS-CoV si lega sia al pipistrello che alle cellule umane e il virus può infettare entrambi gli organismi ( Ge et al., 2013 ; Kuhn et al., 2004 ). La superficie RBD di S1 ​​/ ACE2 implica 14 aa nell'S1 di SARS-CoV ( Li et al., 2005). Tra questi, 8 residui sono rigorosamente conservati nel 2019-nCoV, a sostegno dell'ipotesi che ACE2 sia anche il recettore del nuovo emergente nCoVWan et al., 2020 ). La proteina S2 contiene il peptide di fusione (FP), un secondo sito proteolitico (S2 '), seguito da un peptide di fusione interno (IFP) e due domini di ripetizione dell'eptad che precedono il dominio transmembrana (TM) ( Fig. 2 ). In particolare, gli IFP del 2019-nCoV e SARS-CoV sono identici e mostrano le caratteristiche dei peptidi di fusione virale ( Fig. 2 ). Sebbene il meccanismo molecolare coinvolto nell'ingresso cellulare non sia ancora completamente compreso, è probabile che sia FP che IFP partecipino al processo di ingresso virale ( Lu et al., 2015) e quindi la proteina S deve essere probabilmente scissa in entrambi i siti di scissione S1/S2 e S2 per l'ingresso del virus. Il sito di scissione S2 ′ simile alla furina a KR ↓ S F con residui di base P1 e P2 e un Phe idrofobo P2 ′ ( Seidah e Prat, 2012 ), a valle dell'IFP è identico tra 2019-nCoV e SARS-CoV ( Fig 2 ). Nel MERS-CoV e HCoV-OC43 il sito S1 / S2 è sostituito da R XX R ↓ SA, con residui basici P1 e P4 e un'Ala (non alifatica) a P2 ′, suggerendo una scissione un po 'meno favorevole della furina. Tuttavia, nell'altro CoV umano circolante meno patogeno, il sito di scissione S2 ′ mostra solo una sequenza R ↓ S monobasica ( Fig. 2) senza residui di base in P2 e / o P4 necessari per consentire la scissione della furina, suggerendo una scissione meno efficiente o una restrizione più elevata nella fase di ingresso a seconda delle proteasi cognate espresse dalle cellule bersaglio. Anche se l'elaborazione a S2 ′ nel 2019-nCoV dovrebbe essere un evento chiave per l'attivazione finale della proteina S, le proteasi coinvolte in questo processo non sono state ancora identificate in modo definitivo. Sulla base 2019-nCoV S2 'sequenza e gli argomenti di cui sopra, si propone che uno o più enzimi furina simile  sarebbe fendere l'S2' sito a KR ↓ S F . Contrariamente a S2 ', la prima scissione tra RBD e FP (sito di scissione S1 / S2, Fig. 2 ) è stata ampiamente studiata per molti CoV ( Lu et al., 2015). È interessante notare che il sito di elaborazione S1/S2 presenta diversi motivi tra i coronavirus ( Fig. 2 , sito 1 e sito 2), con molti di essi che mostrano la scissione dopo un residuo di base. 
È quindi probabile che il processo di innesco sia assicurato da diverse proteasi delle cellule ospiti a seconda della sequenza del sito di scissione S1 / S2. Di conseguenza, la proteina S MERS-CoV, che contiene un motivo R SV R ↓ S V, viene scissa durante l'uscita del virus, probabilmente per azione della furinaMille e Whittaker, 2014 ). Al contrario, la proteina S della SARS-CoV rimane in gran parte incompiuta dopo la biosintesi, probabilmente a causa della mancanza di un sito di scissione simile alla furina (SLL R-ST). In questo caso, è stato riportato che in seguito al legame del recettore la proteina S viene suddivisa in una sequenza conservata AYT ↓ M (situata a 10 aa valle di SLL R -ST) dalle proteasi delle cellule bersaglio come elastasi, cathepsin L o TMPRSS2Bosch et al., 2008 ; Matsuyama et al., 2010 , 2005 ; Millet and Whittaker, 2015 ). 
Poiché l'evento di innesco è essenziale per l'ingresso del virus, l'efficacia e l'estensione di questa fase di attivazione da parte delle proteasi delle cellule bersaglio dovrebbero regolare il tropismo cellulare e la patogenesi virale. Nel caso della proteina S 2019-nCoV, la sequenza AYT ↓ M del sito conservato 2 può ancora essere scissa, possibilmente dopo la scissione della furina preferita nel sito 1 ( Fig. 2 ).
Poiché la furina è altamente espressa nei polmoni, un virus avvolto che infetta il tratto respiratorio può sfruttare con successo questa convertasi per attivare la sua glicoproteina superficialeBassi et al., 2017 ; Mbikay et al., 1997 ). Prima dell'emergere del 2019-nCoV, questa importante caratteristica non era stata osservata nel lignaggio b dei betacoronavirus. Tuttavia, è condiviso da altri CoV (HCoV-OC43, MERS-CoV, MHV-A59) che ospitano siti di scissione simili alla furina nella loro proteina SFig. 2 ; Tabella 1 ), che hanno dimostrato di essere processati dalla furina sperimentalmente ( Le Coupanec et al., 2015 ; Mille and Whittaker, 2014). Sorprendentemente, la sequenza S-proteina del 2019-nCoV contiene 12 nucleotidi aggiuntivi a monte del singolo sito di scissione Arg ↓ 1 ( Fig. 1 , Fig. 2 ) che porta a una sequenza P R RA R ↓ S V esposta in modo predittivo , che corrisponde in un canonico sito di scissione simile a una furina( Braun e Sauter, 2019 ; Izaguirre, 2019 ; Seidah e Prat, 2012 ). Questo sito di scissione simile alla furina, dovrebbe essere scisso durante l'uscita del virus ( Mille and Whittaker, 2014) per il "priming" della proteina S e può fornire un guadagno di funzione (gain-of-function) al 2019-nCoV per un'efficace diffusione nella popolazione umana rispetto ad altri betacoronavirus della discendenza b. Questo forse illustra un percorso evolutivo convergente tra CoV non correlati. È interessante notare che se questo sito non viene elaborato, si prevede che la proteina S venga scissa nel sito 2 durante l'endocitosi virale, come osservato per la SARS-CoV.
Ovviamente è necessario molto più lavoro per dimostrare sperimentalmente la nostra affermazione, ma l'inibizione di tali enzimi di elaborazione può rappresentare una potenziale strategia antivirale. In effetti, è stato recentemente dimostrato che, nel tentativo di limitare le infezioni virali, le cellule ospiti che sono infettate da una serie di virus provocano una risposta mediata da interferone per inibire l'attività enzimatica degli enzimi simili alla furina. È stato anche dimostrato che l'infezione da HIV induce l'espressione del recettore attivato per proteasi 1 (PAR1) ( Kim et al., 2015 ) o delle proteine ​​leganti guanilate 2 e 5 (GBP 2,5) ( Braun e Sauter, 2019 ) che limitano il traffico di furina verso il transRete Golgi (PAR1) o ai primi comparti del Golgi (GBP2,5) in cui la proproteina convertasi rimane inattivaComplessivamente, queste osservazioni suggeriscono che gli inibitori degli enzimi simili alla furina possono contribuire a inibire la propagazione del virus.
Sono stati proposti vari approcci per inibire l'attività della furina per limitare la crescita tumorale, l'infezione virale e batterica. Pertanto, una variante dell'antitripsina α-1 presente in natura inibitore della proteasi che ospita una scissione di furina consensuale, chiamata α-1 antitripsina Portland (α1-PDX), inibisce la furina e impedisce il trattamento dell'HIV-1 Env ( Anderson et al., 1993 ). L'aggiunta di una porzione di clorometilchetone (CMK) al terminale C di un motivo di scissione polibasico e un gruppo decanoile al terminale N per favorire la penetrazione cellulare (dec-RVKR-cmk) ha bloccato irreversibilmente l'attività enzimatica di furina, PC7, PC5 , PACE4 e PC7 ( Decroly et al., 1996 , Garten et al., 1994). Infine, la delucidazione della struttura cristallina della furina ha portato alla progettazione di un inibitore derivato da 2,5-dideoxystreptamine, in cui due molecole dell'inibitore formano un complesso con furina ( Dahms et al., 2017 ). Poiché gli enzimi simili alla furina sono coinvolti in una moltitudine di processi cellulari, una questione importante sarebbe quella di evitare l'inibizione sistemica che può provocare una certa tossicità. Di conseguenza, è probabile che tali inibitori di piccole molecole, o altri più potenti per via orale, eventualmente erogati per inalazione e che mostrano un lento tasso di dissociazione dalla furina per consentire un'inibizione sostenuta, meritano di essere rapidamente testati per valutare il loro effetto antivirale rispetto al 2019- nCoV.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione della Fondazione CIHR n. 148363 (NGS), una Canada Research Chairs in Precursor Proteolysis (NGS; # 950-231335 ) e dall'European Virus Archive Global (BCo; EVA GLOBAL) finanziato dall'orizzonte dell'Unione Europea Programma di ricerca e innovazione 2020 nell'ambito della convenzione di sovvenzione n . 871029 .
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